Técnicas
de análises morfo-funcional
do tecido ósseo
Newton
Macha *
David Serson
*
Artigo publicado na Revista Univer.fidade de Guarulhos -Ciências
Biológicas e da Saúde, Ano 11- n" 5- 1997.
RESUMO
Os autores descrevem de forma resumida diversas
técnicas para o estudo do tecido ósseo. ( Assinalam a aplicabilidade de cada
uma delas, ressaltando seu valor para fins didáticos, científicos e de diagnóstico.
Destacam que esse é um trabalho inicial de apresentação
de uma série a ser publicada posteriormente. As publicações vindouras deverão
conter um detalhamento refinado, tanto teórico como de aplicabilidade à Implantologia
Odontológica.
ABSTRACT
The authors describe in a concise way, various
techniques for the study of the bone tissue.
They distinguish the applicability of each
technique, emphasizing its value for didactic, scientific and diagnosis purposes.
They also point out that this is an inicial
presentation work, in a sequence which will be published afterwards
The coming publications will have detailed
contents, as well as the applicability on dental Implantology.
PALAVRAS-CHAVE
Tecido Ósseo, Microscopia,
Técnicas de Estudo, Histologia.
KEY WORDS
Bone Tissue: Microscopy,
Methods of Study.
INTRODUÇÃO
Na área odontológica, todas
as especialidades, sem exceção, estão envolvidas com o tecido ósseo. Suas condições
de higidez, suas variações de arquitetura, sua extensa patologia, requerem por
si só, por parte do profissional, um conhecimento bem consolidado de sua natureza.
O diagnóstico bem firmado, propicia bases
para a terapêutica, gerando condições para o bom planejamento, que por sua vêz
induz ao prognóstico. Interligados, constituem a chave do sucesso.
Os recursos semióticos - palpação digital,
crepitação, sondagens, transiluminação, podem numa primeira análise, permitir
um diagnóstico presuntivo, especialmente nos estádios mais avançados. Nas lesões
ósseas interiorizadas, que se traduzem morfologicamente com maior discrição,
impõe-se a utilização dos Raios X, ou de cintilografia.
Os recursos atuais que dispomos incluem
múltiplas escolhas - variação angular, contrastes, panorâmicas, topográficas,
densitométricas, uso de isótopos ou biópsias são valiosas ferramentas especializadas
de trabalho, já incorporadas à rotina clínica.
Quando necessitamos de uma avaliação em
nível sistêmico, recorremos
ao laboratório clínico: paratohormônio, calcitonina, relação cálcio-fósforo.
Como todos os métodos, eles interagem entre si e sofrem
limitações.
Destarte, de forma resumida e abrangente, procuramos
enfeixar a análise morfo-funcional do tecido ósseo especialmente no que se refere
a parte macro e microscópica.
Quando nossas questões se referem ao metabolismo celular,
subcelular ou molecular - particularmente na área de pesquisa -, em geral, nos
utilizamos de tecnologia de maior refinamento. As mesmas são objeto do presente
trabalho.
Durante o transcorrer do mesmo, abordaremos as linhas
gerais de cada uma das técnicas utilizáveis, bem como a parte interpretativa
e a aplicabilidade das mesmas.
O que se pretende é o desenvolvimento de uma série de
artigos nos quais serão ampliados e detalhados, cada tópico assinalado neste
trabalho inaugural.
Ressalvamos que as diferentes colorações e meios de montagem
não serão aqui abordadas.
DISCUSSÃO
Como já foi dito anteriormente, faremos um breve relato
de algumas das principais técnicas de processamento do tecido ósseo.
Salientamos que as mesmas não apresentam ordem preferencial,
cronológica ou de maior ou menor importância.
Assim, sequencialmente:
MACERAÇÃO E DESGASTE
São os métodos mais antigos que se conhecem. Esse
fato não os invalida, sendo os mesmos indispensáveis na prática rotineira. Servem
para estudos macro e mesoscópicos de peças cirúrgicas, material didático, análise
arquitetônica, textural e microscópica.
O material dispensa o uso de fixação prévia. Após a
sua remoção, deverá sofrer maceração. Esta consiste no amolecimento por mergulhamento
e decomposição parcial dos tecidos moles. Isso pode ser realizado com o uso
de diferentes líquidos - soro iodado, álcool, hidróxido de sódio ou potássio,
bicromato de potássio, hipoclorito de sódio, ou mesmo, lavagem abundante e prolongada
em água corrente.
Inicialmente, removem-se os tecidos moles (fascia, aponevrose,
nervos, músculos) com o auxílio de instrumental cirúrgico. Em seguida, macera-se,
eliminando o restante dos tecidos moles: osteocitos, osteoclastos, periósteo,
endósteo, enfim, todos os restos celulares.
Após secagem em estuda, o material deverá ser laminado
com discos rotatórios cortantes, para sofrer posterior desgaste até a espessura
em tomo de 100 a 200 mm. Esta etapa é realizada em pedras, manualmente, ou em
discos rotatórios automatizados.
O material assim preparado terá condições de ser examinado
com uma simples lupa ou após montagem em meio apropriado, em microscopia óptica
convencional. Englobamos assim, uma análise macro e microscópica, estudando
arquitetura, textura e interrelações celulares e tecidual (plastos). (Gatenby
& Beams 1950)
DESCALCIFICAÇÃO
Dentre os tecidos mineralizados, o tecido ósseo
é constituído basicamente por vários tipos de colágeno associados, principalmente
do tipo I, - a proteoglicanas, que se complexam com sais minerais (apatitas)
em diferentes arranjos (lamelar Haversiano e lamelar esponjoso) ou de forma
desordenada (plexiforme, embrionário).
Em virtude da dureza do tecido ósseo causada pela complexação
dos sais minerais, que impossibilita a microtomia por métodos convencionais,
faz-se necessária uma prévia descalcificação para a remoção das apatitas.
Diversos ácidos têm sido propostos tais como: clorídrico,
nítrico, sulfúrico, fórmico, acético, cítrico, assim como misturas compensatórias
que visam abrandar as lesões artefatuais dos tecidos, causadas pela ação dos
mesmos.
As misturas ou as variações de concentração ácida oferecem
opções múltiplas em função do tipo de osso, região selecionada anatomicamente,
tamanho da peça, tempo de descalcificação e resultado pretendido (o osso celular
constitui-se num exemplo típico).
Acrescente-se a essas técnicas, a descalcificação eletrolítica,
a quelação com EDTA (etileno-diamino tetra-acetato sódico) e a utilização de
microondas.
Quaisquer das variantes pode ser utilizada após fixação
ou concomitantemente. (Gabe 1976)
DESCALCIFICAÇÃO-CONGELAÇÃO
Após fixação e descalcificação, os ossos podem ser cortados
em microtomia de congelação com neve carbônica, em micrótono elétrico ou em
criostato.
Ao remover exclusivamente os sais minerais, preserva-se toda
a celularidade do tecido ósseo.
Em virtude disso, seu uso, para fins didáticos e científicos
possibilita o exame dos prolongamentos dos osteocitos.
HISTOMORFOMETRIA
Consiste numa análise histológica quantitativa de biopsia
óssea, referente aos componentes celulares e intercelulares da mesma. O balanço
metabólico do tecido ósseo está na dependência de um equilíbrio entre neoformação
e reabsorção. As alterações dessa gangorra biológica se traduzem como patologias
e podem ser avaliadas com o método proposto.
Este consiste numa adaptação da planimetria ponto a ponto,
a um microscópio, onde utilizamos uma ocular integradora de inúmeros traços
distribuídos assimetricamente. Os pontos de interseção das áreas em estudo com
esses traços (hits) são contados exaustivamente, correlacionados matematicamente
e representados graficamente. O método é demorado, requer pessoal bem treinado
e de custo operacional elevado. Entretanto, é valiosíssimo, e de momento, a
única solução no estudo da osteoporose, quando o uso de outros recursos de avaliação
são limitados. (Szejnfeld et al. 1987).
MICROTOMIA SEM FIXAÇÃO SEM DESCALCIFICAÇÃO
Utilizando protetores criobiológicos, o osso pode
ser cortado em baixas temperaturas, em criostatos especiais, da forma já assinalada.
Os especialistas consideram este o único e o melhor método de tratamento, quando
se pretende localizar, e mensurar com precisão, substâncias lábeis no interior
das células ósseas ou na matriz extracelular (pequenas moléculas ou enzimas
de oxi-redução). (Chayen & Bitensky 1991)
CULTURA DE ÓRGÃO (embrionária)
Permite o crescimento proliferativo de pequenos fragmentos
de tecido ósseo embrionário tais como: calvários, esboço de membros superiores
ou inferiores, fragmentos de mandibula. Os mesmos são removidos e manipulados
cuidadosamente sob lupa estereoscópica -assepticamente -e explantados sobre
lamínula. Recebem como meio nutriente, extrato embrionário e/ou plasma e os
tecidos são cultivados na lamínula montada sobre lâminas escavadas. Podemos
desta forma, acompanhar etapas evolutivas do crescimento. É excelente para estudos
de ossificação intramembranosa e endocondral. (Bourne 1956)
CULTURA DE ÓRGÃO (adulto)
Nesta, um fragmento de tecido ósseo adulto é removido,
repousando sobre um suporte de aço inoxidável (grade). Interposto entre ambos,
um papel absorvente, embebido no líquido nutriente, contido dentro de uma câmara
especialmente construída para tal fim. O conjunto é mantido numa atmosfera úmida
com C02/ O2 (95:5%) pelo tempo necessário. Podemos utilizar vários fragmentos
em diferentes séries. Assim, na primeira cuba, teremos o material controle e
subsequentemente, nas outras, diferentes concentrações logarítmicas de fármacos
(ensaio citoquímico de hormônios). Após o ensaio, os mesmos poderão ser dosados
bioquímica ou citoquimicamente. (TrowelI1959).
CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS
Inicialmente, os tecidos são dissociados com o uso de enzimas
líticas. Após sucessivas passagens e separações em meio nutriente, obtém-se
o isolamento de uma linhagem celular. Em virtude do crescimento se realizar
em uma única camada (monolayer), em grande parte das vezes, as células perdem
suas características morfológicas. Via de regra, a identificação das mesmas
é feita funcionalmente. Para tanto, as marcações celulares são das organelas,
valendo-se de métodos citoquímicos. As células isoladas são mantidas em frascos,
contendo meio nutriente, com renovação frequente e mantidas com viabilidade
em torno de uma semana. Podemos utilizá-Ias para estudos morfológicos e bioquímicos.
(Parker & Morgan 1960).
CULTIVO CELULAR ( clonagem)
Partindo-se de uma linhagem de cultura primária, isola-se
uma única célula que pode perpetuar a sua multiplicação. O sistema requer experiência,
condições técnicas aprimoradas, equipamento e meio de cultura adequados. As
células ósseas são difíceis de serem clonadas, Parker & Morgan (op. cit.)
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
O material é examinado em microscópio de fluorescência
com os devidos filtros excitadores e barreira nos comprimentos de onda desejados.
O cuidado especial reside em pecar por excesso de zelo. A luz ultravioleta é
altamente lesiva à retina em poucos segundos. A fluorescência obtida pode ser
própria do material (intrínseca), induzida previamente com corantes (fluorcromos),
ou com injeção prévia in-vivo.
A resolução é excelente e possibilita o estudo do crescimento
incremental do tecido ósseo. Nesses casos, as biópsias ósseas de pacientes com
diferentes idades ou metabolismo podem ser analisadas com formulação matemática.
É também valiosa para estudos dinâmicos realizados experimentalmente com
animais. (Pearse 1968).
CITOQUÍMICA
É uma microquímica celular fundamentada em conceitos
de química analítica, orgânica, bioquímica, físico-química e matemática. Abrange
todos os capítulos da bioquímica (proteínas, enzimas, cabrioidratos e lipídeos),
além da análise de produtos inorgânicos. É possível quantificar com grande precisão
através de varredura ou "plug", Pearse (op. cit)
IMUNOCITOQUÍMICA
O avanço da citoquímica, criando um capítulo à parte,
levou à identificação de macromoléculas com alta especificidade, estabelecidos
os devidos controles. A base é a conjugação de compostos (anticorpos) com marcadores
visualizáveis em microscopia convencional ou em microscopia eletrônica de transmissão,
Pearse ( op. cit.)
CONTRASTE DE FASE
Dispositivos especiais adaptados
aos microscópios comuns nos permitem notar mínimas diferenças de fase luminosa.
Teremos então um fundo brilhante com o material escuro ou vice-versa (fase negativa
ou positiva). Nas células, diferente tonalidades de cinza contrastarão nitidamente
as organelas. Ideal para a observação de células vivas, sua movimentação de
organelas, viabilidade das mesmas e refratometria. (Françon 1952).
MICROSPIA DE LUZ POLARIZADA
Imaginemos dois retângulos paralelos entre si: cada um,
tendo também uma fenda central com o mesmo paralelismo. Se vibramos um corda
pelas fendas, ela passará por ambas as fendas sem dificuldade. No momento que
girarmos uma delas, isso não mais ocorrerá.
No fenômeno luminoso, a luz vibra em todos os planos. Quando
a luz é polarizada, somente as ondas que vibram num único plano poderão passar
pelas fendas paralelas. Nesta analogia, a primeira fenda seria o polarizador,
e a segunda o analisador, correspondente ao microscópio.
Os microscópios especializados (POL) ou dispositivos adaptáveis
aos microscópios comuns, fazem com que a luz se torne polarizada, sendo inclusive
mensurável.
Os cristais e as macromoléculas possuem uma propriedade
que é o de oferecer brilho quando atravessados pela luz polarizada (birrefringência).
Esse fenômeno é aproveitado pelos investigadores para determinação
de eixos cristalinos e para a orientação molecular, quando da conjugação com
corantes. (Mellors 1955) e (Pollister 1966).
MICROSCOPIA INTERFERENCIAL
Nesta utiliza-se luz polarizada, que se divide em dois
feixes: um, ordinário, que segue sem alteração direcional e outro, extraordinário
que sofre desvio no seu rumo. Dispositivos especiais ou microscópicos especializados,
baseados em diferentes sistemas ópticos, permitem que o feixe de luz passando
pelo objeto em questão e o referencial, interfiram entre si. É possível dosar
essas interferências luminosas em ordem milesimal. Isso nos possibilita medir
espessura de cortes com precisão, pesar substâncias (DNA/RNA), massa seca, proteínas,
conteúdo de água nas células. (Rale 1958).
MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO
Qualquer método que ilumine o material a ser examinado, impedindo luz diretamente
para a objetiva. Com dispositivos especiais, teremos dois tipos de iluminação:
para objetos grandes, imagens formadas por luz refletida. Para partículas pequenas:
luz dispersa. Assim, as mesmas aparecerão claras sobre um fundo escuro, com
um brilho acentuado. Excelente para constatar lesões celulares (membranas lipoprotéicas),
causada pelos fixadores (Françon 1952). .,
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
O microscópio eletrônico permite aumentar as imagens
com alta resolução, possibilitando examinar o material com uma enorme riqueza
de detalhes. O mesmo possui um filamento -catódio -que graças ao aquecimento
no vácuo emite elétrons. Os mesmos são acelerados devido a diferenças de potencial
existente entre o cátodo e ânodo. Sofrem centralização através de sistema de
condensadores e objetiva e são projetados numa tela fluorescente. A imagem é
formada pelo desvio dos elétrons em função do número atômico dos metais com
os quais se costuma impregnar os cortes ( ósmio, chumbo e urânio). Dessa forma,
após o exame ao microscópio o material é fotografado o que permite uma análise
detalhada "a posteriori". (Junqueira & Carneiro 1995).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Nesta microscopia, há a interposição de um sistema de varredura,
entre o objeto e a lente eletromagnética. Isso possibilita um desvio do feixe
de elétrons, fazendo com que o mesmo incida ponto a ponto de forma sequencial
(varredura). O objeto não é atravessado pelo feixe em virtude da espessura e
de um tratamento prévio -cobertura com ouro - de sua superfície. O sinal elétrico
dos feixes refletidos na superfície são transferidos para um tubo de vídeo.
Permite uma análise tridimensional das células e tecidos.
Junqueira & Carneiro (op. cit.)
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE ALTA VOLTAGEM
Neste microscópio, os elétrons são acelerados sob uma
forte tensão (1 a 3 milhões de volts) penetrando em espécimens com espessura
de várias micra. Devido a essas características, em condições de pressão
e umidade normais, podem ser observados brevemente minúsculos seres vivos com
aumentos gigantescos. (Roland & Szõllõsi 1982).
HISTOAUTORRADIOGRIA
Injetando-se precursores radioativos em diferentes
doses ou tempos, ou ambos, em animais, é possível realizar sua captação nos
tecidos cortados histologicamente. A técnica mais usual é proceder inicialmente
sua coloração, após o que os cortes são recobertos em câmara escura com uma
emulsão fotográfica. Após algum tempo (variável) é feita a revelação e montagem.
Nos locais onde houve incorporação do isótopo radioativo aparecerão pontos negros
que são o resultado da precipitação dos grãos de prata na película fotográfica,
marcando assim, por transparência, os locais de atividade celular ou extra-celular,
Junqueira & Carneiro (op. cit.)
ANÁLISE DE IMAGENS
As seções seriadas ou não, de órgãos ou tecidos,
bidimensionais, podem ser transformadas em tridimensionais (esteriológicas),
utilizando-se sistemas semi-automatizados de análise de imagem.
Esse método baseia-se fundamentalmente na reconstrução
de imagens feitas com câmara clara e planimetria, outrora, realizadas manualmente.
O avanço dessa técnica consiste no uso de uma célula
fotoelétrica, que acoplada ao microscópio emite impulsos ampliados para uma
tela de TV .Conectado a esse sistema, um computador com um programa previamente
desenvolvido. As ferramentas de trabalho de processamento incluem dados matemáticos,
geométricos e estatísticos.
A vantagem consiste na velocidade de processamento, congelamento
de imagem, análise de forma, densidade e suas interrelações morfométricas. (Mandarim-de-Lacerda
1995).
Cone por desgaste de área articular mostrando osso compacto e esponjoso ( extraída do livro Tratado Histologia de Bloom & Fawcett - Interamericana 1975).
Canais de Havers vistos com luz polarizada (extraída do livro Guided Bone Regeneration in Implant Dentisty de Buser, Dahlin, Schenk- Quintessence Publishing Co. Inc. 1994).
Desenho mostrando osteocitos com suas finas ramificações (extraída do livro Histology de Weiss & Greep-Mc Graw-Hill Book Company ).
Microscópio eletrônico de alta voltagem do CNRS- Toloulouse ( extraída do livro Atlas de Biologie Celularie de Roland, Szóllósi & Szóllósi Masson 1982).
CONFOCAL
Utiliza microscopia de fluorescência porém não há decaimento
expressivo e pode ser utilizado em cortes espessos. O princípio da confocalidade
é a coerência dos feixes transmitidos e refletidos. Utilizando-se filtros especiais
(pinhole) obtém-se imagem de apenas um plano focal, com nitidez absoluta. É
possível utilizar-se de três diferentes fluorcromos simultaneamente, variando-se
os canais de registro. Esses fluorcromos podem ainda ser corantes vitais. (Lenzin
et al. 1996).
CRIOFRATURA
Os cortes sofrem vitrificação, isto é, o processo metabólico
é paralisado em 1/500 a 1I1000 do segundo a baixíssimas temperaturas
de congelamento com o uso do nitrogênio líquido ou hélio. Devido à velocidade,
o arranjo molecular polimérico da água é impedido, evitando-se a formação de
cristais de gelo. O material é posteriormente submetido a uma sublimação a vácuo,
sofre fratura, vaporização de carbono e de metal e é finalmente analisado. Esta
técnica condicionou grande avanço nos estudos de membranas celulares e suas
diferentes junções tais como: "gap" e "tight junction",
Roland & Szõllõsi 1982 (op. cit.).
REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS
BOURNE, H.G. 1956. The Biochemistry and Physiology of Bone. New York, Academic Press. P. VIl + 875.
CHAYEN, I. & BITENSKY,
L. 1991. Practical Histochemistry. Chischester, John Wiley & Sons.
P. XIV + 321.
FRANÇON, M. 1952. Le Contraste de Phase et le Contraste para Interferénces. Paris, ed. Rev. d'Otique Théorique et instrumentale. 264 p.
GABE, M. 1976. Histological Techiniques. Paris, Masson & Springer-Verlag. P. xxrn + 260.
GATENBY, B. J. & BEAMS, W. H. 1950. The Microtomist's. Vade-mecum (Bolles Lee) London, J. & Churchill Ltd., p. vm + 112.
HALE, A. J. 1958. The Inteiferance Microscope in Biological Research. Edinburg. E. & S. Livingstone LTD., p. vm + 112.
JUNQUEIRA, L. C. &
CARNEIRO, J. 1995. Histologia Básica. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan.
433 p.
LENZIN, H. L.; PELAJO-MACHADO, M.; VALE, B.S.; PANASCO DE SOUZA, M. 1996. Microscopia de Varredura Laser Confocal: I Princípios de Aplicações. Newslab (Microscopia) 16:62-71.
MANDARIM-DE-LACERDA, C. A. 1995. Rio de Janeiro, Métodos Quantitativos em Morfologia. Eduerjjp. 131 p.
MELLORS, R. C. 1955. Analytical Cytology. New York, Mac Graw Hill. P. X + ln1 a 9J22.
PARKER, R. C. & MORGAN, J. F. 1960. Methods of Tissue Culture. New York. Paul. B. Hoeber, Inc.. p. XII + 294.
PEARSE, A. G. E. vol. 1, 1968; vol. 2, 1972. Histochemistry Theoretical and Applied. London. J. & A. Churchill Ltd.. p. VII + 1518.
POLLISTER, A. W. 1966. Physical Techniques in Biological Research. New York. Academic Press. Vol. m, part A. XII + 408.
ROLAND, J. C. & SZÔLLÔSI,
A. 1982. Atlas de Biologie Cellulaire. Masson, 3a ed. 116 p.
TROWELL, O. A. 1959.
The Culture of Mature Organs in a Synthetic Medium. Exp. Cell. Res., 16:118-147.
SZEJNFELD, V. L.; CARVALHO, A. B.; SATO, E. I.; ATRA, E. 1987, Histomorfometria Óssea e Osteoporose. Rev. Bras. Reumat. 27:87-92.
* Centro
de Implantes da Universidade de Guarulho.