Técnicas de
análises
morfo-funcional do tecido ósseo
Resumo
Os autores descrevem de forma resumida diversas técnicas
para o estudo do tecido ósseo.Assinalam
a aplicabilidade de cada uma delas, ressaltando seu valor para fins didáticos,
científicos e de diagnóstico.
Destacam que esse é um trabalho inicial de apresentação de uma série a ser
publicada posteriormente. As publicações vindouras deverão conter um detalhamento
refinado, tanto teórico como de aplicabilidade à Implantologia Odontológica.
Abstract
The authors describe in a concise way, various techniques
for e the study of the bone tissue.
They distinguish the applicability of each technique,
emphasizing its value for didactic, scientific and diagnosis purposes.
They also point out that this is an inicial presentation
work, in a sequence which will be published afterwards. The coming publications
will have detailed contents, as well as the applicability on dental Implantology.
Palavras-Chave
Tecido Ósseo, Microscopia, Técnicas de
Estudo, Histologia.
Key
Words
Bone Tissue: Microscopy, Methods of Study.
Introdução
Na área odontológica, todas as especialidades, sem
exceção, estão envolvidas com o tecido ósseo. Suas condições de higidez, suas
variações de arquitetura, sua extensa patologia, requerem por si só, por parte
do profissional, um conhecimento bem consolidado de sua natureza.
O diagnóstico bem firmado, propicia bases para
a terapêutica, gerando condições para o bom planejamento, que por sua vez
induz ao prognóstico. Interligados, constituem a chave do sucesso.
Os recursos semióticos -palpação digital, crepitação,
sondagens, transiluminação, podem numa primeira análise, permitir um diagnóstico
presuntivo, especialmente nos estádios mais avançados.
Nas lesões ósseas interiorizadas, que se traduzem
morfologicamente com maior discrição, impõe-se a utilização dos Raios X, ou
de cintilografia.
Os recursos atuais que dispomos incluem múltiplas
escolhas - variação angular, contrastes, panorâmicas, topográficas, densitométricas,
uso de isótopos ou biópsias são valiosas ferramentas especializadas de trabalho,
já incorporadas à rotina clínica.
Quando necessitamos de uma avaliação em
nível sistêmico, recorremos ao laboratório clínico: paratohormõnio, calcitonina,
relação cálcio-fósforo.
Como todos os métodos, eles interagem entre si e sofrem
limitações.
Destarte, de forma resumida e abrangente, procuramos enfeixar
a análise morfo-funcional do tecido ósseo especialmente no que se refere a
parte macro e microscópica.
Quando nossas questões se referem ao metabolismo celular,
subcelular ou molecular - particularmente na área de pesquisa -, em geral,
nos utilizamos de tecnologia de maior refinamento. As mesmas são objeto do
presente trabalho.
Durante o transcorrer do mesmo, abordaremos as linhas
gerais de cada uma das técnicas utilizáveis, bem como a parte interpretativa
e a aplicabilidade das mesmas.
O que se pretende é o desenvolvimento de uma série
de artigos nos quais serão ampliados e detalhados, cada tópico assinalado
neste trabalho inaugural.
Ressalvamos que as diferentes colorações e meios de
montagem não serão aqui abordadas.
Discussão
Como já foi dito anteriormente, faremos um breve relato
de algumas das principais técnicas de processamento do tecido ósseo. Salientamos
que as mesmas não apresentam ordem preferencial, cronológica ou de maior ou
menor importância.
Assim, sequencialmente:
Maceração e Desgaste
São os métodos mais antigos que se conhecem.
Esse fato não os invalida, sendo os mesmos indispensáveis na prática rotineira.
Servem para estudos macro e mesoscópicos de peças cirúrgicas, material didático,
análise arquitetônica, textural e microscópica.
O material dispensa o uso de fixação prévia.
Após a sua remoção, deverá sofrer maceração. Esta consiste no amolecimento
por mergulhamento e decomposição parcial dos tecidos moles. Isso podé ser
realizado com o uso de diferentes líquidos -soro iodado, álcool, hidróxido
de sódio ou potássio, bicromato de potássio, hipoclorito de sódio, ou mesmo,
lavagem abundante e prolongada em água corrente.
Inicialmente, removem-se os tecidos moles (fascia,aponevrose,
nervos, músculos) com o auxílio de instrumental cirúrgico. Em seguida, macera-se,
eliminando o restante dos tecidos moles: osteocitos, osteoclastos, periósteo,
endósteo, enfim, todos os restos celulares.
Após secagem em estufa, o material deverá ser
laminado com discos rotatórios cortantes, para sofrer posterior desgaste até
a espessura em torno de 100 a 200 mm. Esta etapa é realizada em pedras, manualmente,
ou em discos rotatórios automatizados.
O material assim preparado terá condições
de ser examinado com uma simples lupa ou após montagem em meio apropriado,
em microscopia óptica convencional. Englobamos assim, uma análise macro e
microscópica, estudando arquitetura, textura e inter-relações celulares e
tecidual (plastos). (Gatenby & Beams 1950)
Descalcificação
Dentre os tecidos mineralizados, o tecido ósseo é
constituído basicamente por vários tipos de colágeno associados, principalmente
do tipo I, -a proteoglicanas, que se complexam com sais minerais (apatitas)
em diferentes arranjos (Iamelar Haversiano e lamelar esponjoso) ou de forma
desordenada (plexiforme, embrionário).
Em virtude da dureza do tecido ósseo causada pela complexação
dos sais minerais, que impossibilita a microtomia por métodos convencionais,
faz-se necessária uma prévia descalcificação para a remoção das apatitas.
Diversos ácidos têm sido propostos tais como: clorídrico,
nítrico, sulfúrico, fórmico, acético, cítrico, assim como misturas compensatórias
que visam abrandar as lesões artefatuais dos tecidos, causadas pela ação dos
mesmos.
As misturas ou as variações de concentração ácida oferecem
opções múltiplas em função do tipo de osso, região selecionada anatomicamente,
tamanho da peça, tempo de descalcificação e resultado pretendido (o osso celular
constitui-se num exemplo típico).
Acrescente-se a essas técnicas, a descalcificação eletrolítica,
a quelação com EDTA (etileno-diamino tetra-acetato sódico) e a utilização
de microondas.
Quaisquer das variantes pode ser utilizada após fixação
ou concomitantemente. (Gabe 1976)
Descalcificação-Congelação
Após fixação e descalcificação, os ossos podem ser cortados
em microtomia de congelação com neve carbônica, em micrótono elétrico ou em
criostato.
Ao remover exclusivamente os sais minerais, preserva-se
toda a celularidade do tecido ósseo.
Em virtude disso, seu uso, para fins didáticos e científicos
possibilita o exame dos prolongamentos dos osteocitos.
Histomorfometria
Consiste numa análise histológica quantitativa de
biopsia óssea, referente aos componentes celulares e intercelulares da mesma.
O balanço metabólico do tecido ósseo está na dependência de um equilíbrio
entre neoformação e reabsorção. As alterações dessa gangorra biológica se
traduzem como patologias e podem ser avaliadas com o método proposto.
Este consiste numa adaptação da planimetria ponto
a ponto, a um microscópio, onde utilizamos uma ocular integradora de inúmeros
traços distribuídos assimetricamente. Os pontos de interseção das áreas em
estudo com esses traços (hits) são contados exaustivamente, correlacionados
matematicamente e representados graficamente. O método é demorado, requer
pessoal bem treinado e de custo operacional elevado. Entretanto, é valiosíssimo,
e de momento, a única solução no estudo da osteoporose, quando o uso de outros
recursos de avaliação são limitados. (Szejnfeld et al. 1987).
Microtomia sem Fixação sem descalcificação
Utilizando protetores criobiológicos, o osso pode
ser cortado em baixas temperaturas, em criostatos especiais, da forma já assinalada.
Os especialistas consideram este o único e o melhor método de tratamento,
quando se pretende localizar, e mensurar com precisão, substâncias lábeis
no interior das células ósseas ou na matriz extracelular pequenas moléculas
ou enzimas de oxi-redução ). (Chayen & Bitensky 1991)
Cultura de Órgão (embrionária)
Permite o crescimento proliferativo de pequenos fragmentos
de tecido ósseo embrionário tais como: calvários, esboço de membros superiores
ou inferiores, fragmentos de mandibula. Os mesmos são removidos e manipulados
cuidadosamente sob lupa estereoscópica - assepticamente -e explantados sobre
larnínula. Recebem como meio nutriente, extrato embrionário e/ou plasma e
os tecidos são cultivados na lamínula montada sobre lâminas escavadas. Podemos
desta forma, acompanhar etapas evolutivas do crescimento. É excelente para
estudos de ossificação intramembranosa e endocondral. (Bourne 1956)
Cultura de Órgão (adulto)
Nesta, um fragmento de tecido ósseo adulto é removido, repousando
sobre um suporte de aço inoxidável (grade). Interposto entre ambos, um papel
absorvente, embebido no líquido nutriente, contido dentro de uma câmara especialmente
construída para tal fim. O conjunto é mantido numa atmosfera úmida com CO2
/O2 (95:5%) pelo tempo necessário. Podemos utilizar vários fragmentos em diferentes
séries. Assim, na primeira cuba, teremos o material controle e subsequentemente,
nas outras, diferentes concentrações logarítmicas de fármacos (ensaio citoquímico
de hormônios). Após o ensaio, os mesmos poderão ser dosados bioquímica ou
citoquimicamente. (Trowell 1959).
Cultivo Primário de Células
Inicialmente, os tecidos são dissociados com o uso de enzimas
líticas. Após sucessivas passagens e separações em meio nutriente, obtém-se
o isolamento de uma linhagem celular. Em virtude do crescimento se realizar
em uma única camada (monolayer), em grande parte das vezes, as células perdem
suas características morfológicas. Via de regra, a identificação das mesmas
é feita funcionalmente. Para tanto, as marcações celulares são das organelas,
valendo-se de métodos citoquímicos. As células isoladas são mantidas em frascos,
contendo meio nutriente, com renovação frequente e mantidas com viabilidade
em torno de uma semana. Podemos utilizá-Ias para estudos morfológicos e bioquímicos.
(Parker & Morgan 1960).
Cultivo Celular (clonagem)
Partindo-se de uma linhagem de cultura primária, isola-se
uma única célula que pode perpetuar a sua multiplicação. O sistema requer
experiência, condições técnicas aprimoradas, equipamento e meio de cultura
adequados. As células ósseas são difíceis de serem clonadas, Parker &
Morgan (op. cit.)
Microscopia
de Fluorecência
O material é examinado em microscópico de fluorescência
com os devidos filtros excitadores e barreira nos comprimentos de onda desejados.
O cuidado especial reside em pecar por excesso de zelo. A luz ultravioleta
é altamente lesiva à retina em poucos segundos. A fluorescência obtida pode
ser própria do material (intrínseca), induzida previamente com corantes (fluorcromos),
ou com injeção prévia in vivo.
A resolução é excelente e possibilita o estudo do
crescimento incremental do tecido ósseo. Nesses casos, as biópsias ósseas
de pacientes com diferentes idades ou metabolismo podem ser analisadas com
formulação matemática. É também valiosa para estudos dinâmicos realizados
experimentalmente com animais. (Pearse 1968).
Citoquímica
É uma microquímica celular fundamentada
em conceitos de química analítica, orgânica, bioquímica, físico-química e
matemática. Abrange todos os capítulos da bioquímica (proteínas, enzimas,
cabrioidratos e lipídeos), além da análise de produtos inorgânicos. É possível
quantificar com grande precisão através de varredura ou .'plug", Pearse
(op. cit.)
Imunocitoquímica
O avanço da
citoquímica, criando um capítulo à parte, levou à identificação de macromoléculas
com alta especificidade, estabelecidos os devidos controles. A base é a conjugação
de compostos (anticorpos) com marcadores visualizáveis em microscopia convencional
ou em microscopia eletrônica de transmissão, Pearse (op. cit),.
Contraste
de Fase
Dispositivos especiais adaptados aos microscópios comuns nos permitem notar
mínimas diferenças de fase luminosa. Teremos então um fundo brilhante com
o material escuro ou vice-versa (fase negativa ou positiva). Nas células,
diferente tonalidades de cinza contrastarão nitidamente as organelas. Ideal
para a observação de células vivas, sua movimentação de organelas, viabilidade
das mesmas e refratometria. (Françon 1952).
Microspia
de Luz Polarizada
Imaginemos dois
retângulos paralelos entre si: cada um, tendo também uma fenda central com
o mesmo paralelismo. Se vibramos um corda pelas fendas, ela passará por ambas
as fendas sem dificuldade. No momento que girarmos uma delas; isso não mais
ocorrerá.
No fenômeno luminoso,
a luz vibra em todos os planos. Quando a luz é polarizada, somente as ondas
que vibram num único plano poderão passar pelas fendas paralelas. Nesta analogia,
a primeira fenda seria o polarizador, e a segunda o analisador, correspondente
ao microscópio.
Os microscópios
especializados (POL) ou dispositivos adaptáveis aos microscópios comuns, fazem
com que a luz se torne polarizada, sendo inclusive mensurável.
Os cristais e
as macromoléculas possuem uma propriedade que é o de oferecer brilho quando
atravessados pela luz polarizada (birrefringência ).
Esse fenômeno
é aproveitado pelos investigadores para determinação de eixos cristalinos
e para a orientação molecular, quando da conjugação com corantes. (Mellors
1955) e (Pollister 1966).
Microscopia
Interferencial
Nesta utiliza-se
luz polarizada, que se divide em dois feixes: um, ordinário, que segue sem
alteração direcional e outro, extraordinário, que sofre desvio no seu rumo.
Dispositivos especiais ou microscópicos especializados, baseados em diferentes
sistemas ópticos, permitem que o feixe de luz passando pelo objeto em questão
e o referencial, interfiram entre si. É possível dosar essas interferências
luminosas em ordem milesimal. Isso nos possibilita medir espessura de cortes
com precisão, pesar substâncias (DNA/RNA), massa seca, proteínas, conteúdo
de água nas células. (Rale 1958).
Microscopia de Campo Escuro
Qualquer método
que ilumine o material a ser examinado, impedindo luz diretamente para a objetiva.
Com dispositivos especiais, teremos dois tipos de iluminação: para objetos
grandes, imagens formadas por luz refletida. Para partículas pequenas: luz
dispersa. Assim, as mesmas aparecerão claras sobre um fundo escuro, com um
brilho acentuado. Excelente para constatar lesões celulares (membranas lipoprotéicas
), causada pelos fixadores (Françon 1952).
Microscopia
Eletrônica de Trasmissão
O microscópio eletrônico permite aumentar as imagens
com alta resolução, possibilitando examinar o material com uma enorme riqueza
de detalhes. O mesmo possui um filamento - catódio - que graças ao aquecimento
no vácuo emite elétrons. Os mesmos são acelerados devido a diferenças de potencial
existente entre o cátodo e ânodo. Sofrem centralização através de sistema
de condensadores e objetiva e são projetados numa tela fluorescente. A imagem
é formada pelo desvio dos elétrons em função do número atômico dos metais
com os quais se costuma impregnar os cortes ( ósmio, chumbo e urânio). Dessa
forma, após o exame ao microscópio o material é fotografado o que permite
uma análise detalhada "a posteriori". (Junqueira & Carneiro
1995).
Microscopia
Eletrônica de Varredura
Nesta microscopia, há a interposição de um sistema
de varredura, entre o objeto e a lente eletromagnética. Isso possibilita um
desvio do feixe de elétrons, fazendo com que o mesmo incida ponto a ponto
de forma sequencial (varredura). O objeto não é atravessado pelo feixe em
virtude da espessura e de um tratamento prévio - cobertura com ouro - de sua
superfície. O sinal elétrico dos feixes refletidos na superfície são transferidos
para um tubo de vídeo.
Permite uma análise tridimensional das células e tecidos.
Junqueira & Carneiro (op. cit.)
Microscópio
Eletrônico de Alta Voltagem
Neste microscópio, os elétrons são acelerados sob
uma forte tensão (1 a 3 milhões de volts) penetrando em espécimens com espessura
de várias micra. Devido a essas características, em condições de pressão e
umidade normais, podem ser observados brevemente minúsculos seres vivos com
aumentos gigantescos. (Roland & Szõllõsi 1982).
Histoautorradiografia
Injetando-se precursores radioativos em diferentes
doses ou tempos, ou ambos, em animais, é possível realizar sua captação nos
tecidos cortados histologicamente. A técnica mais usual é proceder inicialmente
sua coloração, após o que os cortes são recobertos em câmara escura com uma
emulsão fotográfica. Após algum tempo (variável) é feita a revelação e montagem.
Nos locais onde houve incorporação do isótopo radioativo aparecerão pontos
negros que são o resultado da precipitação dos grãos de prata na película
fotográfica, marcando assim, por transparência, os locais de atividade celular
ou extra-celular, Junqueira & Carneiro (op. cit.)
Análise
de Imagens
As seções seriadas ou não, de órgãos ou
tecidos, bidimensionais, podem ser transformadas em tridimensionais (esteriológicas),
utilizando-se sistemas semi-automatizados de análise de imagem.
Esse método baseia-se fundamentalmente na reconstrução
de imagens feitas com câmara clara e planimetria, outrora, realizadas manualmente.
O avanço dessa técnica consiste no uso de uma
célula fotoelétrica, que acoplada ao microscópio emite impulsos ampliados
para uma tela de TV. Conectado a esse sistema, um computador com um programa
previamente; desenvolvido. As ferramentas de trabalho de processamento incluem
dados matemáticos, geométricos e estatísticos.
A vantagem consiste na velocidade de processamento,
congelamento de imagem, análise de forma, densidade e suas inter-relações
morfométricas. (Mandarim-de-Lacerda 1995).
| 1 - Corte pos desgaste de área articular mostrando osso compacto e esponjoso (extraído do livro Tratado Histologia de Bloom & Fawcett - Interamericana 1975) |
| 2 - Canais de Havers vistos com luz polarizada (extraída do livro Guided Bone Regeneration in Implant Dentistry de Buser, Dahlin, Schenk-Quintessense Publishing Co. Inc. 1994) |
| 3 - Desenho mostrando osteócitos com suas finas ramificações (extraída do livro Histology de Weiss & Greep-McGraw-Hill Book Company) |
| 4 -Microscópio eletrônico de alta voltagem do CNRS-Tolouse (extraído do livro Atlas de Biologie Cellularie de Roland, Szollosi & Szollosi Masson 1982) |
Confocal
Utiliza microscopia de fluorescência porém não há
decaimento ( expressivo e pode ser utilizado em cortes espessos. O princípio
da confocalidade é a coerência dos feixes transmitidos e refletidos. ( Utilizando-se
filtros especiais (pinhole) obtém-se imagem de apenas um plano focal, com
nitidez absoluta. É possível utilizar-se de três diferentes fluorcromos simultaneamente,
variando-se os canais de registro. Esses fluorcromos podem ainda ser corantes
vitais. (Lenzin et al. 1996).
Criofratura
Os cortes sofrem vitrificação, isto é, o processo
metabólico é paralisado em 1/500 a 1/1000 do segundo a baixíssimas temperaturas
de congelamento com o uso do nitrogênio líquido ou hélio. Devido à velocidade,
o arranjo molecular polimérico da água é impedido, evitando-se a formação
de cristais de gelo. O material é posteriormente submetido a uma sublimação
a vácuo, sofre fratura, vaporização de carbono e de metal e é finalmente analisado.
Esta técnica condicionou grande avanço nos estudos de membranas celulares
e suas diferentes junções tais como: "gap" e "tight junction",
Roland & Szollosi 1982 (op. cit.).
Referências Bibliográficas