Obtencão
de matriz mineral de osso bovino
e a comprovação de sua biocompatibilidade
RESUMO
A estrutura óssea bovina, tanto
na condição de tecido cortical como medular, viabiliza através de processo termo-químico
a obtenção de material mineral rico em cálcio e fósforo com características
funcionais plenamente
adequadas para sua aplicação como enxerto reabsorvível e condutor para reparações
de defeitos ósseos. A implantação de cilindros deste material em tíbia
de coelho com posterior análise histológica por microscopia de luz, eletrônica
e fluorescência, comprovam a integração biocompatível com a matriz óssea original
e o estímulo condutor na neoformação tecidual rico em atividade celular
para a reparação óssea do leito receptor
INTRODUÇÃO
Desde a década de setenta, composições
cerâmicas à base de cálcio e fósforo tem sido extensivamente estudadas e utilizadas
como materiais para a inclusão permanente em estruturas ósseas defeituosas ou
anômalas. Na década de oitenta, dois reveiews foram realizados sobre as cerâmicas
de cálcio e fósforo, seus possíveis processos de obtenção, suas condições termodinâmicas
de equilíbrio em soluções e no estado sólido, e suas possíveis aplicações no
processo de reconstrução do tecido ósseo. Partindo do princípio que todo e qualquer
tecido ósseo natural contém compostos minerais comuns a todos os seres vivos,
utilizou-se o tecido ósseo bovino como matéria prima para a obtenção
de cilindros compostos puramente de matéria mineral para serem inseridos em
tíbia de coelho.
Após um período de oito semanas
os animais foram sacrificados e o implante lnserido na tíbia do animal
era removido com o tecido ósseo que o envolvia. Os pontos de inserção dos implantes
eram próximos à articulação do joelho e com isso, foi obtido o material ósseo
próximo à epífise proximal. Constatou-se a neoformação de tecido ósseo no interior
do material implantado, e esse partia inicialmente da cortical da tíbia para
o centro do enxerto, como pontes ósseas que se irradiavam. A análise, foi realizada
em microscopia de luz, eletrônica e fluorescência, onde pôde-se observar os
diferentes períodos de deposição óssea.
MATERIAIS e MÉTODOS
I. Processo de obtenção dos cilindros implantáveis.
Tecido ósseo da cabeça do
fêmur bovino foi processado termoquimicamente com o único objetivo de se retirar
todo e qualquer material orgânico existente, sem promover alterações da parte
mineral natural. Os passos do processo estão representados no fluxograma da
figura I (processo da empresa PRO-LINE Serviços e Produtos Odontológicos
e Ortopédicos Ltda)
II. Análise
química da estrutura de osso mineral bovino.
Análise clínica posterior ao
processamento tem como finalidade verificar o teor de impurezas e contaminantes,
oriundos do próprio processo ou da dieta alimentar do animal doador passível
de influenciar no fenômeno da osseointegração e neoformação óssea do animal
implantado. Esta análise foi obtida para a estrutura mineral bovina pelo método
de fluorescência de raios-X.
III. Cristalinidade da estrutura do osso mineral bovino.
Quanto a cristalinidade
da estrutura mineral do osso bovino, esta foi obtida por difração de raios-X,
onde a tabela II apresenta os tamanhos dos cristalitos pelo método de Scherrer
e fase pela ficha 9-432 da International Centre for Diffraction Data. Os dados
foram obtidos comparativamente com aqueles da hidroxiapatita natural.
IV. Teste de citotoxicidade.
Foi feito o ensaio "in
vitro" de citotoxicidade em células de ovário de hamster chinês, conforme
procedimento adotado por Rogero et alli.
V. Experimento em animais.
Para a realização da fase
experimental foram utilizados coelhos machos da Nova Zelândia com 3Kg de peso
aproximado, onde foi exposta a região próxima à epífise proximal da tíbia e
colocados os cilindros-enxertos em leitos de mesmo diâmetro. Após a implantação
e durante o período de manutenção, os animais receberam injeções subcutâneas
doscorantes na seguinte sequência: Alizarina, Calceína e Tetraciclina de acordo
com Kõnig Jr.
Após um tempo de cicatrização
de 8 semanas os animais foram sacrificados por meio de dose excessiva de Hypnol
e os implantes removidos juntamente como osso que os envolve, para preparação
dos métodos histológicos.
VI. Preparação
histológica.
As amostras de osso com
os respectivos implantes foram fixadas em solução neutra de formalina a 4 %,
sendo preparadas para a desidratação em etanol absoluto e água destilada. As
amostras foram incluídas com Technovit VLC a 1% de peróxido de benzolla dissolvido
em etanol, cortadas com disco de diamante, lixadas e polidas até se obter espessuras
de 40 a 100mm. O método de coloração foi o de Escarlate de Biebrich (hematoxilina
férrica, água destilada e ácido fosfomolíbdico fosfotúngstico).
RESULTADOS
I. Material de enxertia.
A estrutura do cilindro-enxerto
é porosa (poros de 10 a 20um) e cavidades de osteoblastos (I a 2 um) originais
do animal, doador, e face a isto, o material oferece características friáveis
sob baixa carga mecânica. A análise química representativa dos cilindros porosos
pode ser vista na tabela 1.
Tabela
1
Análise química do cilindro-enxerto
|
ELEMENTO
|
TEOR (%)
|
ELEMENTO
|
TEOR(%)
|
|
P2O5
|
40,1
|
TiO2
|
<
0,001
|
|
CaO
|
55,1
|
CuO
|
0,003
|
|
SiO2
|
0,039
|
SrO
|
0,097
|
|
MgO
|
0,69
|
SeO2
|
<
0,001
|
|
Fe2O3
|
0,018
|
V2O5
|
0,001
|
|
Al2O3
|
0,016
|
As2O3
|
<
0,001
|
|
K2O
|
0,006
|
HgO
|
0,001
|
|
Cl
|
0,013
|
MoO3
|
<
0,001
|
|
MnO
|
0,001
|
CdO
|
0,007
|
|
SO3
|
0,14
|
Cr2O3
|
0,012
|
|
NiO
|
0,004
|
Na2O
|
0,49
|
|
ZnO
|
0,017
|
O grau de cristalinidade do osso mineral
bovino apresenta-se menor do que o da hidroxiapatita natural, conforme pode
ser observado na tabela II pelo tamanho dos cristalitos.
Tabela 2
Tamanho dos cristalitos do osso mineral bovino e
hidroxapatita natural
|
Amostra
|
Reflexão
002
|
Reflexão
310
|
Reflexão
213
|
Fase
|
|
Osso
bovino
|
166
angstron
|
70
angstron
|
----------
|
Ca5(PO4)3(OH)
|
|
Ha
natural
|
263
angstron
|
216
angstron
|
----------
|
Ca5(PO4)3(OH)
|
O
ensaio de citotoxicidade apresenta potencial citotóxico para a matriz mineral
do osso bovino com IC
50 de 35, o que
significa o extrato deste material diluído a 35% inibiu a formação de colônias
em 50%. Isto é apresentado na figura 2.
Após o processamento, a superfície
da estrutura mineral do cilindro-enxerto, apresenta-se isenta de resíduos orgânicos,
conforme mostrado por microscopia eletrônica de varredura nas figuras 3 e 4.
II. Análise
histológica.
Após o período de 8 semanas
observou-se o cilindro-enxerto com tecido ósseo neoformado, de padrão similar
ao osso compacto adjacente e exibindo uma conformação característica, com grande
quantidade de células ósseas, que invadem o enxerto, conforme visto por microscopia
de luz e apresentado na (figuras 5 e 6)
Identifica-se a emissão de processos
ósseos da cortical em direção ao centro do enxerto, ocorrendo uma indução a
neoformação óssea na medular do coelho, que normalmente apresenta-se com grande
quantidade de tecido adiposo. As figuras 7 e 8 confirmam a existência dos prolongamentos
ósseos neoformados, que se iniciam em superfícies próximas à cortical.
Por microscopia eletrônica de
varredura (fig.9) observa-se de forma tridimensional o verificado por microscopia
de luz, onde na região das pontes ósseas, formações contínuas se estabelecem
entre a cortical e o enxerto. Isto também é visto por microscopia de fluorescência
(fig, 10), onde a alizarina em cor verde esta depositada próximo à cortical,
e novas deposições em amarelo (calceína), confirma que a neoformação inicia-se
na cortical e é progressiva em direção ao enxerto. Nota-se ainda a calcificação
intercalada e não sequencial dos anéis de formação da osteona.
DISCUSSÃO
A composição química da matriz mineral
do cilindro-enxerto conforme apresentada na tabela I, atende aos requisitos
das normas ASTM F1088-87 e F1185-88 para implantes de â-fosfato tricálcico e
hidroxiapatita respectivamente o que eliminaria qualquer correlação de possível
grau de incompatibilidade biológica com o caráter químico da estrutura do material.
Processo de obtenção do enxerto, composto só pela parte mineral da estrutura
óssea original, podem ser obtidos na literatura como, por exemplo, o utilizado
por O'KELLY comparando as propriedades mecânicas da hidroxiapatita porosa com
a estrutura mineral trabeculada do osso bovino, onde mostrou que para a mesma
densidade, este úitimo tem cerca de 40 a 50% a mais de resistência mecânica.
O importante em cada processo de obtenção, é identificar o nível de contaminação
mínimo possível que o mesmo irá deixar no produto final. Assim, quanto menos
reagente químico e solventes de material orgânico forem utilizados na preparação
do material em atenção, menor a possibilidade de não se atender as especificações
normativas existentes para este tipo de produto. No presente caso, todos os
reagentes foram cuidadosamente selecionados, minimizados e avaliados através
da diferença em composição química, principalmente quanto a metais pesados,
do osso serviu de matéria prima antes e depois de processado.
Fig. 3 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 4 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 5 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 6 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 7 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 8 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 9 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
Fig. 10 - Superfície do cilindro-enxerto sob aumento de
50X
A menor cristalinidade da estrutura
mineral do osso bovino em relação à hidroxiapatita natural, a qual é sintetizada
a partir do primeiro, está de acordo com o esperado, pois este processo termo-cerâmico
de síntese objetiva transformar a hidroxiapatita defeituosa e fases outras
existentes na estrutura em hidroxiapatita mais cristalina . Esta composição
de diversas fases de sais de fósforo e cálcio menos estáveis
que a hidroxiapatita sob a ação metabólica durante o processo
de osteogênese, pode influenciar no tipo do neo-tecido a ser formado,
o que está sendo estudado atualmente pelos autores.
O fato da
estrutura mineral do cilindro-enxerto apresentar certo potencial cititóxico,
decorrente possivelmente de percentual remanescente não detectado de
orgaânicos na matriz mineral, ao mesmo tempo atender quimicamente as normas
ASTN para implantes cerâmicos e demonstrar sua capacidade funcional como
material ósteo-condutor, justifica porque não é possível especificar um único
método de testes de biocompatibilidade e sim orientações conforme sugere a norma
ASTM F748-9. BASLÉ et alli estudando a resposta celular do osso bovino mineralizado
e hidroxiapatita, observou após implantação uma maior atividade de osteoblastos
com consequente mais rápida formação óssea na superfície do osso bovino
que na hidroxiapatita, considerando que isto não depende somente da composição
química do implante, mas possivelmente também do tipo de tecido e espécie animal
receptor, reforçando assim a validade da
norma ASTM F748-91.
WATZSC utilizando o osso bovino desproteinado
no preenchimento de seios paranasais de cães, verificou o estímulo à formação
de um novo osso lamelar e aposição simultânea sobre os implantes. Já o estudo
de CHANG, a formação e remodelação óssea foi influenciada pelo tipo de material
implantado, pelas propriedades da superfície e também pelo local de implantação.
Neste trabalho, constata-se que tais considerações se confirmam, onde a formação
óssea mais abundante é aquela adjacente ao periósteo, ocorrendo uma migração
em direção ao centro do material implantado.
CONCLUSÃO
O enxerto mineral de origem bovina se apresenta como um material biocompatível com os tecidos sendo potencialmente capaz de conduzir o processo de neoformação óssea com um conteúdo celular característico assemelhando-se na sua estrutura acelular a um osso adulto normal.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.